FIKSASI BASAH KERING

MAKALAH SITOHISTOTEKNOLOGI

“FIKSASI BASAH KERING”

Disusun oleh :

1.      Agathanica Astiwulan R                           (A.102.06.002)

2.      Anggraheni Heksaningtyas                       (A.102.06.004)

3.      Bunga Yunia Ratna Prima                        (A.102.06.009)

4.      Lina Oktavia                                             (A.102.06.017)

5.      Novihantari Anggraini                              (A.102.06.021)

6.      Rosita Noor Rahma                                  (A.102.06.027)

AKADEMI ANALIS KESEHATAN NASIONAL

SURAKARTA

2011

BAB I

PENDAHULUAN

          Histoteknik adalah metoda atau cara/proses untuk membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk

1. Bahan pengajaran dan praktikum mahasiswa, guna mempelajari bentuk dan struktur jaringan tubuh tertentu yang normal.
2. Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan percobaan yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.
3. Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien

Untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan sitoplasma; badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen dsbnya); susunan serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup.

 Sajian yang baik dapat membantu mahasiswa memahami struktur histologi jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.

Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih (valid/akurat) yang sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. Di samping itu sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita oleh pasien.

Histoteknik ini dapat dilakukan oleh staf pengajar, peneliti atau teknisi laboratorium. Setiap staf pengajar bagian biomedik harus menguasai teknik pembuatan sajian histologi dengan baik, karena setiap staf pengajar bagian biomedik dituntut untuk dapat melakukan riset yang sering kali melibatkan teknik pembuatan sediaan histologi. Setiap peneliti sebaiknya membuat sajian histologi sendiri, karena dengan melakukannya sendiri setiap peneliti dapat mengetahui kesulitan-kesulitan yang terjadi sekaligus cara untuk mengatasinya. Disamping peneliti juga dapat mengamati hal-hal yang terjadi pada jaringan selama proses pembuatan sajian.

Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan oleh teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas sajian histologi yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol.

Setelah jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian histologi. Rangkaian proses pembuatan sajian histologi terdiri atas

1. Fiksasi (Fixation)
2. Dehidrasi (Dehydration)
3. Pembeningan (Clearing)
4. Pembenaman (Impregnasi/Embedding)
5. Pengecoran (Blocking)
6. Pemotongan jaringan (Sectioning)
7. Pewarnaan (Staining)
8. Perekatan (Mounting)
9. Pelabelan (Labelling)

BAB II

PEMBAHASAN

Pengawetan/fiksasi adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga unsur tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua sajian histologi yang baik. Kesalahan yang dilakukan pada tahap ini tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada tahapan selanjutnya. Jadi, hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara melakukan fiksasi dengan baik.

A. TUJUAN FIKSASI

1.      Mengawetkan jaringan

Fiksasi akan mempertahankan susunan jaringan agar mendekati kondisi sewaktu hidup. Tujuan fiksasi adalah mengawetkan jaringan secara permanen sedekat mungkin dengan keadaan saat hidup. Fiksasi sebaiknya dikerjakan sesegera mungkin setelah pengambilan jaringan (pada kasus patologi bedah) atau segera setelah kematian (dengan otopsi) untuk mencegah otolisis. Tidak ada bahan pengawet yang sempurna; formalin mendekati kesempurnaan. Dengan demikian, bahan pengawet yang digunakan bergantung pada jenis jaringan dan fitur yang akan didemonstrasikan. Seringkali larutan pengawet merupakan campuran dari berbagai bahan pengawet sehingga dapat memaksimalkan kemampuan masing-masing bahan atau mengurangi kelemahan bahan lainnya.

2.      Mengeraskan jaringan

Fiksasi bertujuan untuk mengeraskan jaringan terutama jaringan lunak sehingga memudahkan pembuatan irisian yang tipis.

B.     EFEK FIKSASI TERHADAP JARINGAN

1.      Menghambat proses pembusukan dan autolysis

Fiksasi akan menghambat terjadinya pembusukan yang disebabkan oleh kuman pembusuk dari dalam/luar tubuh. Waktu pembusukan untuk setiap jaringan/organ adalah berbeda tergantung pada konsistensi dan kandungan unsur penyusun jaringan. Usus dan otak sangat rentan terhadap proses pembusukan dibandingkan dengan jaringan tubuh lainnya. Pembusukan sering disertai oleh pembentukan gas yang berbau.

Autolisis adalah proses kerusakan jaringan tubuh yang disebabkan enzim-enzim proteolitik yang terdapat pada sel/jaringan tersebut. Proses proteolitik ini akan lebih cepat terjadi pada suhu tropik (24 – 36 oC). Proses proteolitik juga lebih mudah terjadi di negeri tropis dibanding dengan negeri iklim sub tropik. Untuk menghindari proses pembusukan dan autolisis, jaringan harus segera dimasukkan ke dalam cairan fiksasi segera setelah kematian atau diambil dari tubuh. Bila keadaan ini tidak memungkinkan, jaringan dapat disimpan sementara dengan dibekukan dalam ruang bertemperatur dingin (freezer, -20 oC) atau dengan nitrogen cair (-70 oC)

2.      Pengawetan jaringan

3.      Pengerasan jaringan

4.      Pemadatan koloid

Fiksasi akan mengubah konsistensi sel yang setengah cair (sol) menjadi lebih padat (gel).

5.      Diferensiasi optic

Fiksasi akan mengubah indeks refraksi berbagai unsur sel dan jaringan. Sebelum diwarnai, struktur jaringan yang telah difiksasi akan lebih mudah dilihat dibandingkan dengan struktur jaringan yang belum difiksasi.

C.    PENGARUH FIKSASI TERHADAP PEWARNAAN

Cairan fiksasi dapat mempengaruhi reaksi histokimia karena mengikat bagian reaktif jaringan. Ada sejumlah faktor yang akan mempengaruhi proses pengawetan:

1.      Dapar

Pengawetan sebaiknya dikerjakan pada pH yang mendekati netral, 6 – 8. Jaringan hipoksia menurunkan pH, sehingga harus terdapat kapasitas dapar pada pengawet untuk mencegah keasaman yang berlebihan. Keasaman memudahkan terbentuknya pigmen heme-formalin yang akan muncul sebagai deposit hitam yang dapat terpolarisasi di jaringan. Dapar umum terdiri atas fosfat, bikarbonat, kakodilat, dan veronal.

2.      Penetrasi

Penetrasi jaringan bergantung pada kemampuan difusi masing-masing fiksatif. Formalin dan alkohol adalah yang terbaik sementara glutaraldehida adalah terjelek. Merkuri dan yang lainnya berada di antaranya. Untuk mengatasi ini, jaringan diiris dengan ketipisan 3–5 mm. Jaringan yang tipis akan lebih mudah dipenetrasi daripada jaringan tebal. Untuk pekerjaan rutin, jaringan dapat dibuat dengan ketebalan hingga 1 cm. Dengan ketebalan ini, diharapkan cairan fiksasi dapat dengan cepat memfiksasi seluruh jaringan. Bila irisannya terlalu tebal, maka permukaan luarnya saja yang berhasil difiksasi sedangkan bagian tengahnya dapat membusuk sebelum cairan fiksasi sempat merembes/menginfiltrasi ke sana. Untuk mikroskopi elektron, ketebalan irisan jaringan adalah 1 mm.

3.      Volume Pengawet

Volume pengawet adalah penting. Sebaiknya, volume pengawet adalah 10 x volume jaringan yang difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebalnya jaringan menentukan lamanya fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang digunakan.

4.       Konsentrasi

Konsentrasi pengawet sebaiknya diatur ke kadar terendah yang mungkin, karena pertimbangan ekonomis. Konsentrasi formalin terbaik adalah 10%, sedangkan glutaraldehida pada 0,25% - 4%. Konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menimbulkan artefak yang sama dengan panas yang berlebihan.

5.      Interval Waktu

Jaringan yang didapat harus segera diawetkan. Artefak akan timbul bila jaringan mengering, sehingga bila belum mendapat pengawet, rendamlah dalam larutan garam fisiologis. Semakin lama jaringan menunggu untuk diawetkan, semakin banyak kehilangan organel sel dan pengerutan nukleus sehingga banyak artefak terbentuk.

6.      Suhu

Peningkatan suhu, seperti reaksi kimia lainnya, akan meningkatkan laju pengawetan. Ini tidak berarti bahwa anda dibenarkan untuk merebus jaringan dalam bahan pengawet. Formalin yang panas akan mengawetkan lebih cepat.

7.      Jenis Larutan Pengawet

Jenis larutan fiksasi yang akan digunakan bergantung pada jenis unsur jaringan yang ingin didemonstrasikan dan pewarnaan yang akan dilakukan.

D.    KELOMPOK BAHAN PENGAWET

Ada 5 kelompok utama bahan pengawet yang dikelompokkan menurut mekanisme kerja, yaitu aldehydes, mercurials, alcohols, oxidizing agents, dan picrates.

-          Aldehydes

Contoh bahan pengawet kelompok aldehida di antaranya adalah formaldehida (formalin) dan glutaradehida. Jaringan terawetkan oleh cross-linkage yang terbentuk pada protein, khususnya antara residu lysine. Ini tidak banyak mengganggu struktur protein, sehingga antigenisitas tidak menghilang. Dengan demikian, formaldehida cocok untuk teknik imunoperoksidase. Formalin menyusupi jaringan dengan baik, tetapi relatif lambat. Larutan standar adalah formalin dapar netral 10%. Dapar mencegah suasan asam yang akan meningkatkan autolisis dan menyebabkan presipitasi pigmen heme-formol di jaringan.

Formalin digunakan untuk semua jaringan otopsi dan patologi bedah rutin saat preparat HE dibuat. Formalin adalah pengawet yang banyak digunakan untuk kondisi yang tak ideal dan tak ada jaringan yang dirusaknya. Baunya yang menusuk hidung membuat formalin sangat dikenal oleh banyak pihak sehingga cukup berhati-hati dalam mengurusnya. Glutaraldehida menyebabkan deformasi struktur heliks-alfa protein sehingga tidak baik untuk pewarnaan imunoperoksidase. Namun, ia mengawetkan dengan sangat cepat sehingga baik untuk mikroskopi elektron. Ia mempenetrasi dengan lambat, tetapi member rincian sitoplasma dan nukleus. Larutan standar adalah glutaraldehida dapar 2%. Glutaraldehida harus dalam keadaan dingin dan dapar dan tak boleh berumur lebih dari 3 bulan. Jaringan haruslah sesegar mungkin dan irisan jaringan untuk fiksasi glutaradehida adalah tidak boleh lebih tebal dari 1 mm untuk meningkatkan pengawetan.

-          Mercurials

Belum diketahui bagaimana merkuri dapat mengawetkan jaringan. Pengawet Ini memiliki kemampuan rendah dalam hal penetrasi dan menyebabkan beberapa jaringan mengeras, tetapi bekerja cepat dan memberikan rincian nukleus yang sangat bagus. Penggunaan terbaiknya adalah untuk pengawetan jaringan hematopoietik dan retikuloendotel. Karena mengandung merkuri, larutan ini harus dibuang dengan berhati-hati. Pengawet zenker direkomendasikan untuk jaringan retikuloendotel termasuk limfonodus, limpa, timus, dan sumsum tulang. Namun deposit merkuri harus dihilangkan melalui langkah dezenkerisasi sebelum pewarnaan atau deposit hitam akan terbentuk pada preparat.

-          Alcohols

Alkohol, termasuk metil alkohol (metanol) dan etil alkohol (etanol), adalah denaturan protein dan tidak secara rutin digunakan untuk pengawetan jaringan karena menyebabkan terlalu rapuh dan keras. Namun, kemampuannya sangat bagus untuk apusan sel karena kerjanya cepat dan memberi rincian nukleus yang bagus. Alkohol, khususnya etanol, terutama digunakan untuk apusan sel. Etanol (95%) beharga murah dan cepat bekerja. Karena apusan hanya setebal satu sel, tidak ada masalah pengerutan dan kerapuhan (karena apusan sel tak diiris).

-          Oxidizing agents

Oxidizing agents terdiri atas pengawet permanganat (kalium permanganat), dikromat (kalium dikromat), dan osmium tetroksida. Pengawet ini menimbulkan cross-link protein, tetapi menyebabkan denaturasi yang berlebihan.

-          Picrates

Pikrat terdiri dari pengawet dengan asam pikrat, yang terkenal adalah larutan Bouin. Mekanisme aksinya belum diketahui. Hampir sama baiknya dengan merkuri dalam hal rinci nukleus tetapi tidak banyak menimbulkan pengerasan jaringan. Larutan Bouin terkadang direkomendasikan untuk pengawetan jaringan testis, saluran cerna, dan endokrin. Larutan ini juga cukup baik untuk mengawetkan jaringan hematopoiesis. Berdasarkan tujuan pembutan preparat atau keperluan praktis, cairan pengawet dapat dikelompokkan pula menjadi tiga kelompok yaitu:

a.       Microanatomical Fixatives

Jenis ini digunakan apabila struktur histologis jaringan hendak dipertahankan dengan hubungan yang benar antara lapisan jaringan dan kelompok sel. Larutan pengawet yang tergolong kelompok ini adalah larutan formalin atau modifikasinya seperti larutan asam asetatalkohol-formalin, Heidenhain’s Susa, Zenker, dan Bouin.

b.      Cytological Fixatives

Pengawet ini digunakan apabila struktur intraselular atau badan inklusi hendak dipertahankan dan diekspresikan. Untuk mencapai tujuan ini sering dengan mengorbankan penetrasi cairan yang merata, kemudahan pemotongan dengan mikrotom, dan hilangnya struktur sel lainnya. Fiksasi ini dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu fiksasi inti (nuklear) dan fiksasi sitoplasma. Cairan fiksasi yang tergolong dalam kelompok ini adalah fiksasi inti (larutan Carnoy) dan fiksasi sitoplasma (larutan Muller, formal-saline, formal-calcium, Zenker formal).

c.       Histochemical Fixatives

Pengawet ini digunakan apabila jaringan hendak diwarnai dengan pewarnaan histokimia.

Cairan pengawet histokimia yang baik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:

·         Mengawetkan unsur yang akan didemonstrasikan.

·         Mengikat atau mengawetkan unsur jaringan khusus tanpa atau sedikit mempengaruhi gugus reaktif yang digunakan pada visualisasi.

·         Tidak mempengaruhi reagen yang digunakan pada proses visualisasi. Misalnya glutaraldehida memfiksasi protein jaringan dengan menghasilkan suatu selaput gugus aldehida reaktif sehingga menghasilkan reaksi PAS positif.

E.     LARUTAN PENGAWET YANG SERING DIGUNAKAN

-          Larutan Formalin

Larutan formalin merupakan cairan fiksasi yang paling umum digunakan. Larutan formalin yang digunakan adalah formalin 10%. Formula yang digunakan adalah

Formalin (Formaldehida 40%)..................................................... 10 ml

Air .............................................................................................. 90 ml

Formaldehida 40% adalah gas yang larut dalam air dengan volume 40% dari total berat larutan. Larutan jenuh ini secara komersial diperdagangkan sebagai formalin atau formaldehyde 40%. Telah disepakati bahwa yang dimaksud dengan formaldehyde 40% sama dengan larutan jenuh gas formaldehida dalam akuades.

Formalin terutama terdapat dalam bentuk polimer dari formaldehida. Bentuk ini tak dapat digunakan untuk fiksasi; yang dapat digunakan adalah bentuk monomernya. Untuk menghasilkan formalin dalam bentuk monomer diperlukan waktu, kecuali bila pH larutan dibuat netral atau sedikit alkalis, karena kecepatan depolarisasi tergantung pada pH. Jadi jangan sekalikali menggunakan formalin 10% yang baru dibuat karena jaringan akan membusuk sebelum terfiksasi dengan baik. Selain itu formalin bersifat asam karena mengandung asam formiat akibat oksidasi formaldehida. Oleh sebab itu larutan formalin 10% harus dibuat netral atau sedikit alkalis dengan menggunakan larutan dapar fosfat dengan pH 7,2 sebagai pelarut, atau dengan menambahkan kalsium asetat. Larutan yang paling mudah dan murah adalah larutan formalsaline dengan formula:

Formalin (40% formaldehyde) ................................................. 100 ml

Natrium klorida (NaCl).............................................................. 9 gram

Akuades.................................................................................... 900 ml

Larutan dapar formalin 10% yang sering digunakan adalah:

1.      Formal Calcium (Lilli, 1965)

Formalin (40% formaldehyde) ......................................................... 10 ml

Kalsium asetat .................................................................................. 2 gr

Akuades ................................................................................... ad 100ml

2.      Formal Calcium (Baker, 1944)

Formalin (40% formaldehyde)......................................................... 10 ml

Kalsium klorida ........'.......................................................................... 2 gr

Akuades .......................................................................................ad 100 ml

3.      Neutral Buffered Formalin

Formalin ............................................................................................ 10 ml

Acid sodium phosphate monohydrate ............................................... 0,40 gr

Anhydrous disodium phosphate ........................................................ 0,65 gr

Akuades ...........................................................................................ad 100 ml

4.      Buffered Formalin Sucrose (Holt dan Hicks, 1961)

Formalin ............................................................................................. 10 ml

Sukrosa................................................................................................ 7,5 gr

Phosphate buffer saline (pH 7,4)..................................................ad 100 ml

Cairan formalin akan mengawetkan struktur halus (fine structure) dengan sangat baik, fosfolipida, dan beberapa enzim. Cairan ini sangat dianjurkan untuk dipakai pada penelitian gabungan sitokimia dan mikroskopi elektron. Untuk mendapatkan hasil terbaik, jaringan harus didinginkan dalam refrigerator (4oC). adalah: Kelebihan larutan fiksatif formalin

a.       merupakan cairan pengawet umum;

b.      pH mendekati netral;

c.       pigmen formalin (acid formaldehyde haematin) tidak terbentuk.

Pembentukan pigmen formalin akan terjadi bila terdapat interaksi antara larutan formalin ber-pH asam dengan hemoglobin atau produknya. Pigmen formalin sering dijumpai pada organ yang mengandung banyak darah seperti hati, limpa, dan sumsum tulang. Pigmen formalin dapat dihilangkan dengan perlakuan asam pikrat-alkohol atau larutan alkohol 1% dalam natrium hidroksida (NaOH) saat rehidrasi irisan jaringan. Larutan Asam Pikrat-Alkohol (rendam selama ½ - 2 jam)

Larutan asam pikrat jenuh dalam alkohol 70%..............................85 ml

Alkohol 70%.................................................................................15 ml

d.      Potongan jaringan dapat ditinggalkan di dalam cairan formal-saline untuk jangka waktu lama (dapat sampai 1 tahun) tanpa ada perubahan yang berarti;

e.       Bila diperlukan, jaringan yang direndam dalam cairan fiksatif ini dapat diambil dan dimasukkan ke dalam cairan fiksatif lain.

Kekurangan larutan fiksatif formalin adalah:

·         Jaringan yang difiksasi dengan cara rendam memerlukan waktu sedikitnya 24 jam baru dapat diproses.

·         Terjadi pengerutan pada jaringan. Pengerutan ini tidak disebabkan fiksatif formalin (yang menimbulkan sedikit pembengkakan) namun oleh alkohol dalam proses dehidrasi.

·         Formaline-saline menjadi asam saat disimpan lama karena formaldehida teroksidasi menjadi asam format. Jaringan yang disimpan beberapa bulan sering gagal menghasilkan pewarnaan yang baik.

-          Larutan Muller

Cairan fiksasi ini merupakan fiksatif sitologi yang dapat digunakan untuk memfiksasi nucleus dan sitoplasma. Kalium dikromat yang terdapat dalam larutan Muller akan memfiksasi

protein tanpa mempresipitasikannya. Hal ini diduga terjadi karena ion krom membentuk kompleks-kompleks dengan air yang mengikat bagian reaktif rantai protein di dekatnya. Kalium dikromat terutama mengikat gugus karboksil dan hidroksil protein sehingga fiksatif yang mengandung ion krom tidak dapat dipakai untuk histokimia. Kalium dikromat dapat digunakan untuk reaksi kromafin. Setelah difiksasi dengan larutan Muller, jaringan harus dicuci dulu di dalam air kran mengalir selama 24 jam sebelum dilakukan proses dehidrasi. Pemindahan jaringan secara langsung ke dalam alkohol akan menghasilkan oksida yang tak dapat larut dan tak dapat disingkirkaikan lagi dari jaringan.

Kelebihan dari larutan Muller adalah:

·         Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan baik. Jaringan biasanya akan terfiksasi baik dalam waktu 24 jam;

·         Memfiksasi nukleus dan sitoplasma dengan baik.

Kekurangan dari larutan Muller adalah:

·         Jaringan yang difiksasi dengan larutan Muller harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik.

·         Tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metoda histokimia/imunohistokimia;

·         Harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan proses dehidrasi.

Formula larutan Muller adalah:

Kalium dikromat .................................................................. 12,5 gram

Natrium sulfat........................................................................ 5 gram

Akuades .................................................................................ad 500 ml

-          Larutan Bouin

Cairan fiksasi ini mengandung larutan asam pikrat jenuh. Asam pikrat merupakan zat

berbentuk serbuk bewarna kuning seperti kunyit. Asam pikrat mudah meledak dalam keadaan kering sehingga harus disimpan dalam keadaan lembab. Asam pikrat jenuh dibuat dengan cara melarutkan serbuk asam pikrat dalam air hingga jenuh (terdapat endapan serbuk pikrat di dasar larutan). Asam pikrat mempresipitasikan protein dengan membentuk ikatan pikrat-protein. Asam pikrat menyebabkan rusaknya eritrosit, karena menghilangkan Fe3+ terutama bila Fe3+ berada dalam jumlah sedikit, namun dapat melindungi RNA dari proses perusakan oleh enzim ribonuklease.

Kelebihan dari larutan Bouin adalah:

a.       Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata, tetapi dapat menyebabkan terjadinya sedikit pengerutan. Untuk mengatasi hal ini, ke dalam larutan Bouin biasanya ditambahkan asam asetat glasial sesaat sebelum dipakai. Waktu fiksasi cepat yaitu 24 jam, tetapi potongan kecil dengan ketebalan kurang dari 2-3 mm dapat selesai difiksasi dalam 2-3 jam. Jika jaringan difiksasi lebih lama dari 24 jam, jaringan akan menjadi rapuh dan sulit diiris. Penyimpanan yang lama dalam etanol 70% dapat mengakibatkan pengerutan jaringan. Asam asetat glasial sendiri mempunyai kemampuan untuk fiksasi meskipun rendah. Asam asetat glasial biasanya digunakan bersama-sama dengan larutan fiksatif lain dan berfungsi untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh larutan lainnya. Nukleoprotein dipresipitasi oleh asam asetat dan sering ditambahkan pada zat warna hematoksilin agar nukleus tampak jelas dan tajam. Jaringan yang telah difiksasi sebaiknya dipindahkan ke etanol 70%. Penyimpanan yang lama dalam etanol 70% dapat mengakibatkan pengerutan jaringan.

b.      Memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metoda trichrome.

c.       Sangat baik untuk memperlihatkan nukleus dan kromosom seperti pada sel benih testis dan ovum, embrio, dan kulit.

d.      Warna kuning membuat jaringan mudah dilihat saat perendaman dan pengirisan jaringan.

Kekurangan dari larutan Bouin adalah:

a.       Jaringan yang difiksasi dengan larutan Bouin harus segera dilakukan proses dehidrasi setelah 24 jam. Bila jaringan direndam terlalu lama (>24 jam) dapat menyebabkan kerapuhan pada jaringan sehingga tidak mungkin untuk dipotong dengan mikrotom secara baik.

b.      Warna kuning pada jaringan akibat kelebihan pikrat. Untuk menghilangkan warna kuning, jaringan harus dicelup dalam alkohol atau dengan mencucinya dalam air kran semalam. Oleh karena terbentuk beberapa ikatan pikrat yang larut dalam air, jaringan harus segera dipindahkan ke dalam alkohol.

Formula larutan fiksatif Bouin adalah:

Larutan asam pikrat jenuh ......................................................................... 75 ml

Formalin (40% formaldehida)..................................................................... 25 ml

Bila akan digunakan, tambahkan " asam asetat glasial" ............................. 5 ml

-          Larutan Zenker Formol (Cairan Helly)

Larutan fiksatif Zenker mengandung merkuri klorida yang berfungsi untuk mempresipitasi protein. Merkuri klorida akan mengikat gugus asam protein dan gugus asam

fosfat nukleoprotein, dan juga bereaksi secara khusus dengan gugus tiol (−SH).

Kelebihan dari larutan fiksatif Zenker adalah:

a.        Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed. Untuk mengatasi hal tersebut larutan fiksatif ini biasanya dikombinasi dengan asam asetat, formalin, kalium dikromat, dan sebagainya. Waktu fiksasi umunya 6-24 jam.

b.        Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa serta organ lain yang banyak mengandung darah seperti jantung dan otot

c.        Warna sitoplasma jaringan yang difiksasi dengan larutan fiksatif ini akan lebih cemerlang.

Kekurangan dari larutan fiksatif Zenker adalah:

a.       Pemaparan jaringan di dalam larutan fiksatif ini yang melebihi waktu yang ditentukan akan mengakibatkan jaringan menjadi rapuh (keras), overfixed di bagian perifer dan underfixed di tengahnya. Jaringan seperti ini tidak dapat dipotong dengan mikrotom.

Formula larutan Zenker adalah sebagai berikut

Merkuri klorida.......................................................................................... 5 gr

Kalium dikromat……................................................................................. 2,5 gr

Natrium sulfat............................................................................................. 1 gr

Akuades................................................................................................ ad 100 ml

Tambahkan formalin segera sebelum pemakaian...................................... 5 ml

-          Larutan Etil Alkohol (Etanol/Alkohol)

Fiksasi ini biasanya digunakan untuk sajian apusan dan tidak digunakan untuk fiksasi jaringan, sebab larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang lambat ke dalam jaringan dan cenderung mengeraskan jaringan bila jaringan direndam terlalu lama di dalam larutan fiksasi ini. Larutan ini memfiksasi jaringan dengan cara mendenaturasi protein dan mempresipitasi glikogen. Apabila fiksatif ini dicampur dengan reagen lainnya seperti larutan Carnoy, fiksasi berlangsung cepat. Untuk keperluan imunositokimia, larutan metanol absolut dan aseton absolute dengan perbandingan sama dalam suhu -20 oC sering digunakan.

-          Larutan Asam Asetat−Alkohol−Formalin (Tellyesniczky)

Fiksasi ini digunakan untuk mendemonstrasikan glikogen. Larutan ini akan mencegah karbohidrat menjadi larut sebelum unsur protein selesai difiksasi. Karena formalin dan alkohol merupakan zat dengan penetrasi cepat, larutan ini merupakan fiksatif yang kerjanya cepat. Jaringan dengan ketebalan 5 mm selesai difiksasi dalam 4 jam. Asam asetat tidak pernah digunakan sendiri karena efek pembengkakan pada serat kolagen, tetapi ia digunakan untuk meniadakan pengerutan yang disebabkan oleh reagen lainnya. Asam asetat dapat memresipitasi nukleoprotein namun asam asetat juga mampu merusak/menghancurkan mitokondria dan aparatus Golgi.

Formula larutan fiksatif ini adalah:

Formalin .................................................................................................... 5 ml

Asam asetat glasial .................................................................................... 5 ml

Alkohol 70% .............................................................................................. 90 ml

-          Larutan Heidenhain’s Susa

Larutan ini merupakan larutan fiksatif karbohidrat yang sangat baik. Larutan fiksatif ini mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata serta memberikan hasil pulasan yang sangat cemerlang dengan rincian sitologi yang sangat baik. Jaringan dengan ketebalan kurang dari 8 mm selesai difiksasi setelah 12-24 jam. Bila jaringan difiksasi lebih dari 24 jam, jaringan akan menjadi keras dan rapuh.

Formula larutan fiksatif ini adalah:

Merkuri klorida ............................................................................................ 4,5 gr

Natrium klorida .............................................................................................0,5 gr

Trichloracetic acid ......................................................................................... 2 gr

Asam asetat ................................................................................................... 4 ml

Formalin ....................................................................................................... 20 ml

Akuades ...................................................................................................... 100 ml

Kelebihan Larutan Heidenhain’s Susa:

a.        Cocok untuk fragmen bedah yang kecil (biopsi) karena waktu fiksasi yang singkat dan jaringan dapat langsung direndam ke dalam alkohol 80 % atau 90%.

b.      Efek pengerasan adalah menengah.

c.       Menghasilkan sedikit/tanpa deposit fiksasi.

d.      Sebagian besar metoda pewarnaan bekerja baik dengan Susa kecuali trikrom dan impregnasi perak.

Kekurangan Larutan Heidenhain’s Susa:

a.       Hanya potongan tipis jaringan yang dapat digunakan karena penetrasinya jelek.

b.      Jaringan yang direndam lebih dari 24 jam menjadi terlalu keras.

c.       Garam merkuri mempengaruhi logam.

-          Larutan Carnoy

Larutan ini merupakan larutan fiksatif inti yang mempunyai daya penetrasi yang cepat. Disamping itu, larutan fiksatif ini juga akan mengawetkan substansia Nissl dan glikogen. Keuntungan dari larutan Carnoy adalah sangat cepat. Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat, misalnya untuk diagnosis kanker pada saat pembedahan. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam, sedangkan potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit. Kekurangan fiksatif ini adalah efek pengerutan yang kuat dan menghancurkan sebagian besar unsur sitoplasma lainnya Efek pengerutan dapat dikurangi dengan melakukan fiksasi pada suhu nol derajat Celsius selama 18 jam.

Formula larutan Carnoy adalah:

Alkohol absolut ............................ .......................................................... 60 ml

Kloroform ................................................................................................ 30 ml

Asam asetat glasial ................................................................................... 10 ml

F.     CARA PENGAWETAN JARINGAN

Cara melakukan pengawetan jaringan ada 2 macam, yaitu:

1.      Supravital/intravital;

Teknik ini memungkinkan fiksatif mencapai seluruh jaringan dengan lebih cepat karena fiksatif dialirkan ke seluruh tubuh melalui perfusi dengan mesin perfusi. Alat yang digunakan adalah mesin perfusi, wing needle, selang infus. Bahan yang digunakan adalah NaCl fisiologis dan larutan pengawet.

Cara mengerjakannya adalah sebagai berikut: wing needle ditusuk ke ventrikel kiri. Alirkan NaCl fisiologis secukupnya. Buat guntingan/lubang pada atrium kanan. NaCl fisiologis dialirkan secukupnya lalu diganti dengan fiksatif yang sesuai. Mesin perfusi akan mengambil alih fungsi jantung untuk mengalirkan fiksatif melalui pembuluh darah. Fiksasi dilakukan hingga hewan menjadi kaku. Pada tikus (rat), hal tersebut ditandai dengan kakunya ekor tikus. Selanjutnya jaringan yang diinginkan diambil dan difiksasi rendam. Jika anda tidak memiliki mesin perfusi, gunakan tekanan hidrostatik dengan meninggikan botol berisi larutan fiksasi dalam posisi cukup tinggi seperti melakukan infus.

2.      Merendam dalam larutan fiksatif.

Gambar.Merendam jaringan dalam larutan pengawet

1.      Fiksasi kering

Sewaktu secret masih segar semprotkan segera hairspray atau alcohol 95% spray pada obyekglass yang mengandung apusan secret  dengan jarak 10-15 cm sebanyak 2-4x semprot keringkan di udara terbuka 5-10 menit.

BAB III

PENUTUP

A.    KESIMPULAN

Proses untuk mendapat sajian yang baik adalah sebagai berikut :

1.      Fiksasi (Fixation)

2.      Dehidrasi (Dehydration)

3.      Pembeningan (Clearing)

4.      Pembenaman (Impregnasi/Embedding)

5.      Pengecoran (Blocking)

6.      Pemotongan jaringan (Sectioning)

7.      Pewarnaan (Staining)

8.      Perekatan (Mounting)

9.      Pelabelan (Labelling)

Proses fiksasi yang kita lakukan bertujuan untuk Mengawetkan jaringan, Mengeraskan jaringan,Menghambat proses pembusukan dan autolysis,Pemadatan koloid,Diferensiasi optic.

Ada 5 kelompok utama bahan pengawet yang dikelompokkan menurut mekanisme kerja, yaitu aldehydes, mercurials, alcohols, oxidizing agents, dan picrates.Ada sejumlah faktor yang akan mempengaruhi proses pengawetan:

1. Dapar

1.      Penetrasi

2.      Volume Pengawet

3.      Konsentrasi

4.      Interval Waktu

5.      Suhu

6.      Jenis Larutan Pengawet

Setelah melewati prosedur diatas dipastikan kita mendapat sajian yang baik yaitu sajian yang dapat menunjukkan struktur histologi jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup.

DAFTAR PUSTAKA

Perhimpunan Dokter Paru Indonesia. 2003. Pedoman Diagnosis dan           Penatalaksanaan Kanker Paru di Indonesia.

dr.Zulham, M.Biomed. Penuntun Praktikum Histoteknik Biomedik. Departemen     Histoteknik FKUSU

http://histologi.usu.ac.id (diunduh pada hari minggu 3 Oktober 2011 pukul 15:44 )